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細胞培養的步驟和注意事項

导语:细胞培养的步骤包含细胞复苏、细胞传代、细胞冻存等,WIGGENS可在每个步骤提供相对应的細胞培養産品

1、細胞複蘇
將凍存細胞從液氮中取出後,在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中,加入37℃預熱的DMEM完全培養基中(其中胎牛血清約爲10%),輕輕吹勻,離心,500g離心2min,棄上清液。

加入DMEM完全培养基清洗,弃上清液。加入DMEM完全培养基,轻轻吹打混匀,制成细胞悬液,接种于培养皿/瓶中,在含5% CO2的细胞培養箱中培养。


BIOCEN系列離心機


WA系列恒溫水浴

 

2、細胞傳代
当细胞密度达到80%~90%(过早产量不足,过晚细胞状态不佳,1:2至1:10以上的比率传代培养,一般1:3至1:5细胞一代,即从细胞接种到分离再培养的一段时间,非细胞有丝分裂次数)时,去掉完全培养基,用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶(注意:消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度)进行消化,放入细胞培養箱中约2-3min。

加入適量DMEM完全培養基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管後500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM完全培養基清洗,棄上清液。

加入DMEM完全培养基,轻轻吹打混匀,吸取10微升进行计数,然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培養箱继续培养。


WCI系列二氧化碳培養箱


二氧化碳培養箱专用搖床


超高産率微型細胞工廠


高密度培養專用搖瓶

 

3、細胞凍存
当细胞密度达到80%~90%时,去掉完全培养基,用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化,放入细胞培養箱中约2-3min。加入DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化,转移至离心管后500g离心2min,弃上清液,再加入DMEM完全培养基清洗,弃上清液。加入lml冻存液(90%胎牛血清,10%DMSO。 一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整,冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养,另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质,如蔗糖,白蛋白等从而更好地保护细胞),放入凍存管内(管内有异丙醇,以保证温度降低的速度),立即放入4℃冰箱中冻存30min,然后放入-20℃冰箱中冻存30min,再置于-80℃冰箱内过夜。

第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。 

細胞凍存和複蘇的原則是:慢凍速融,這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑,會導致細胞內冰晶的産生,從而使細胞産生內源性的機械損傷,引起細胞內環境滲透壓,PH,電解質等的改變,進而促使細胞死亡。


WIGGENS液氮罐系列


凍存管


凍存支架

4、注意事項

(1)預熱培養用液:把已經配制好的裝有培養液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱;
(2)用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超淨工作台和雙手;
(3)正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且減少汙染;
(4)點燃酒精燈:注意火焰不能太小;
(5)嚴格的無菌操作;
(6)贴壁细胞消化适度:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培養瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化;
(7)傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作,每種細胞使用一套器材。避免交叉感染;
(8)傳代細胞瓶口每次打開或者關閉都需要在酒精燈上消毒。


悬浮细胞培養瓶


贴壁细胞微载体培養瓶


貼壁細胞滾瓶培養

 

 

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